XSELECT HSS XP色譜柱入門指南（含連接安裝及平衡）
每根XSelect HSS XP 2.5μm色譜柱都隨附COA報告和性能測試色譜圖，保存于eCord智能芯片或柱盒內(nèi)。COA報告為XSelect HSS XP 2.5μm色譜柱中所用的填料批次所特有，包括填料批號、未鍵合填料和鍵合填料分析結(jié)果，以及色譜結(jié)果和檢測條件。性能測試色譜圖提供每根色譜柱的以下信息：填料批號、色譜柱序列號、USP理論塔板數(shù)、USP拖尾因子、保留因子以及色譜測試條件。這些數(shù)據(jù)應(yīng)妥善記錄和保存，以備將來參考或通過ACQUITY UPLC控制臺訪問。
a．色譜柱連接
XP 2.5μm色譜柱專為在任意HPLC、UHPLC或UPLC系統(tǒng)上運行而設(shè)計。鑒于缺乏行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，所以請注意，不同系統(tǒng)的接頭和連接件類型會因制造商不同而有所差異，安裝時應(yīng)采用與具體色譜柱相匹配的接頭和連接件。
如果色譜柱末端接頭的類型與壓力螺母/錐箍管路深度設(shè)置匹配不佳，色譜性能會受到負(fù)面影響，或者可能發(fā)生滲漏。
b. 色譜柱安裝
注：下述步驟給出的流速適用于2.1 mm內(nèi)徑色譜柱。請根據(jù)第VI節(jié)（其它信息）中給出的流速和壓力指南調(diào)整流速。
1. 灌注泵系統(tǒng)，排出含緩沖液的流動相，然后連接色譜柱的入口。
2. 用100%有機流動相（甲醇或乙腈）沖洗色譜柱，泵流速設(shè)置為0.1 mL/min，并在5 min內(nèi)增加至0.5 mL/min。
3. 當(dāng)流動相可從色譜柱出口自由流出且無氣泡時，停止液流并將色譜柱出口連接至檢測器。這能防止空氣進(jìn)入檢測系統(tǒng)，使系統(tǒng)更快達(dá)到基線平衡。
4. 按照步驟2所述逐漸增加流速。
5. 監(jiān)控儀器狀態(tài)，直到柱壓和基線達(dá)到穩(wěn)定。
c. 盡可能減小譜帶展寬體積
譜帶展寬是系統(tǒng)擴散性的量度，而系統(tǒng)擴散性可影響色譜性能。內(nèi)部管路直徑和管線連接可顯著影響系統(tǒng)譜帶展寬和色譜性能。管路內(nèi)徑增大會導(dǎo)致峰過寬和靈敏度降低（圖1）。
d. 測量譜帶展寬體積
注：該測試應(yīng)在配備UV檢測器的LC系統(tǒng)上進(jìn)行。
1. 斷開色譜柱與系統(tǒng)的連接，將色譜柱替換為零死體積二通。
2. 將流速設(shè)置為1 mL/min。
3. 制備測試混合物（溶于流動相），使其峰高在0.5 AU-1.0 AU范圍內(nèi)（可使用系統(tǒng)啟動測試混合物，P/N：WAT034544）。
4. 進(jìn)樣此溶液2-5μL。
5. 采用5-Sigma法測量4.4%峰高處的峰寬：
譜帶展寬(μL) = 峰寬(min) x 流速(μL/min)
（比如，如果峰寬 = 0.1 min，流速 = 1000μL/min，則譜帶展寬 = 100μL）
e. 測量系統(tǒng)延遲體積
測量延遲體積比測量系統(tǒng)譜帶展寬更困難。系統(tǒng)延遲體積是初始梯度條件到達(dá)色譜柱柱頭所需體積的量度。在不同LC系統(tǒng)之間轉(zhuǎn)換方法時，計算系統(tǒng)延遲體積尤其有用。
1. 斷開色譜柱與系統(tǒng)的連接，將色譜柱替換為零死體積二通。
2. 使用乙腈作為流動相A，使用0.05 mg/mL的尿嘧啶乙腈溶液作為流動相B。
3. 監(jiān)測254 nm處的UV吸光度。
4. 在目標(biāo)儀器上運行初始方法的流速和預(yù)期流速。
5. 采集運行100%流動相A時的基線5 min。
6. 在5 min處，設(shè)置流動相B為100%，然后繼續(xù)采集數(shù)據(jù)5 min。
7. 測量100%流動相A和100%流動相B之間的吸光度差值。
8. 測定該吸光度差值的50%處的時間。
9. 計算梯度起點與50%點之間的時間差值。
10. 將時間差值乘以流速，計算出系統(tǒng)體積。
f. 色譜柱平衡
XSelect HSS XP 2.5μm色譜柱出廠時保存于100%乙腈中。在更換為其它流動相體系之前，務(wù)必確保流動相的兼容性。請用至少10倍柱體積的流動相平衡色譜柱（色譜柱體積請參閱表3）。當(dāng)柱壓穩(wěn)定后，可認(rèn)為色譜柱已達(dá)到平衡。
為了避免流動相緩沖液在色譜柱或系統(tǒng)中發(fā)生沉淀，請使用5倍柱體積的水/有機溶劑沖洗色譜柱，其中有機溶劑比例應(yīng)與所需緩沖流動相中的有機溶劑比例相同或更低（例如，引
入60%甲醇/40%緩沖液流動相之前，應(yīng)使用60%甲醇水溶液沖洗色譜柱和系統(tǒng)）。
注：如果流動相中的添加劑（如離子對試劑）濃度較低(< 0.2%v/v)，那么完成平衡可能需要100-200倍柱體積的流動相。此外，當(dāng)流動相中含有甲酸鹽（如甲酸銨、甲酸等）時，平衡時間可能會延長。
g. 正相應(yīng)用的溶劑轉(zhuǎn)換
XSelect HSS Cyano XP 2.5μm色譜柱既可用于反相分離，也可用于正相分離。色譜柱出廠時保存于100%乙腈中，可直接用于反相條件。
如果要將XSelect HSS Cyano色譜柱用于正相應(yīng)用，則必須遵循以下溶劑轉(zhuǎn)換步驟：
1. 用至少20倍柱體積的100%甲醇沖洗色譜柱，采用低流速以免LC系統(tǒng)超壓。色譜柱體積信息請參閱表3。
2. 用至少20倍柱體積的100%異丙醇沖洗色譜柱，采用低流速以免LC系統(tǒng)超壓。色譜柱體積信息請參閱表3。
3. 用至少20倍柱體積的100%二氯甲烷沖洗色譜柱，采用低流速以免LC系統(tǒng)超壓。色譜柱體積信息請參閱表3。
4. 采用預(yù)定的流動相條件沖洗色譜柱，直至基線穩(wěn)定。
h. eCord安裝
如果色譜柱是安裝在ACQUITY UPLC系統(tǒng)上，在追蹤和管理色譜柱使用情況時，eCord技術(shù)具有顯著優(yōu)勢。將黃色芯片座與ACQUITY UPLC柱溫箱模塊右側(cè)的讀/寫裝置相連接，即可
讀取eCord。
諸如色譜柱制造QC數(shù)據(jù)和COA報告等內(nèi)置信息隨后可通過ACQUITY UPLC控制臺訪問。
i. 初始柱效測定
1. 使用色譜柱之前，需要先執(zhí)行柱效測試，以追蹤色譜柱性能隨時間的變化情況。這項測試可包括：
a. 您所在實驗室常用的分析測試混合物
b. “性能測試色譜圖”（可通過eCord訪問）中的分析混合物。
注：如果采用(b)項的分析物進(jìn)行柱效測試，那么您所在實驗室在等度條件下測得的柱效可能低于沃特世“性能測試色譜圖”中所示的柱效。
這是正常并且符合預(yù)期的。沃特世對等度色譜柱測試系統(tǒng)進(jìn)行了改造，盡可能減小了系統(tǒng)擴散。目的是更嚴(yán)格地測試色譜柱填充質(zhì)量，同時保證填充柱品質(zhì)。這些經(jīng)過改造的特殊測試系統(tǒng)不再具有商業(yè)可行性，方法的靈活性亦受限，只能用于等度色譜柱測試。
2. 測定理論塔板數(shù)(N)，并定期對比該數(shù)值。
3. 定期進(jìn)行重復(fù)測試，以追蹤色譜柱性能隨時間的變化情況。使用不同的LC系統(tǒng)進(jìn)行測試，所得柱效結(jié)果可能會有微小差異，這可能是由于連接質(zhì)量、運行環(huán)境、系統(tǒng)電子設(shè)備、試劑質(zhì)量、色譜柱條件和操作員技術(shù)等因素所致。
j. VanGuard保護(hù)柱
VanGuard?保護(hù)柱是2.1 mm（內(nèi)徑）x 5 mm（長）保護(hù)柱，可在保護(hù)分析柱的同時，盡可能降低使用保護(hù)柱帶來的負(fù)面擴散影響。VanGuard保護(hù)柱填充的固定相與XP 2.5μm系列
色譜柱相同。VanGuard保護(hù)柱可直接連接eXtended Performance [XP] 2.5μm色譜柱入口。
注：VanGuard保護(hù)柱出廠時配有箍環(huán)和錐箍，但并未固定。因此用戶可根據(jù)具體的XP 2.5μm色譜柱選用匹配的VanGuard保護(hù)柱，確保連接無空隙且無滲漏。
取下將這兩個部件固定至保護(hù)柱管路的O形圈時，必須謹(jǐn)慎操作。
VanGuard保護(hù)柱安裝說明
1. 將VanGuard保護(hù)柱從外盒和包裝套管中取出，取下塑料塞。
2. 固定保護(hù)柱，使外接頭朝上，小心地取出在運輸期間用于固定箍環(huán)和錐箍的黑色O形圈（箍環(huán)和錐箍未進(jìn)行永（yong）久性連接）。
3. 將XP 2.5μm色譜柱入口朝下，垂直于工作臺表面。
4. 從下方將VanGuard保護(hù)柱推入色譜柱入口，然后將色譜柱和保護(hù)柱翻轉(zhuǎn)180°，使保護(hù)柱位于上方。
5. 如圖4所示，將兩個5/16英寸扳手分別置于XP色譜柱的平坦部分和VanGuard保護(hù)柱六角螺母（外接頭）處，然后擰緊。
6. 將VanGuard保護(hù)柱壓在XP 2.5μm色譜柱上，同時擰緊以固定箍環(huán)和錐箍。
7. 松開接口并檢查錐箍深度，確保錐箍完全固定。
8. 將保護(hù)柱低流速純有機相活化后再重新連接至XP 2.5μm色譜柱前端，設(shè)置流速并檢查是否滲漏。
